技术简介
CETSA+MS（细胞热迁移-质谱联用技术）由Molina等于2013年首次提出，巧妙利用"配体结合后靶蛋白热稳定性发生改变"的基本物理化学原理，在完整活细胞中直接验证药物与靶蛋白的结合。
当小分子与靶蛋白结合后，形成的蛋白-配体复合物构象更加稳定，其热变性温度（Tm）会发生上移（热稳定性增强）或下移（热稳定性减弱）。通过梯度加热处理，结合质谱进行全蛋白质组范围的高通量检测，CETSA+MS可在不进行任何化学修饰的前提下，在活细胞中原位识别药物结合靶点，并评估其结合强度。
技术原理
当小分子配体与其靶蛋白特异性结合后，会通过疏水作用、氢键及静电相互作用诱导靶蛋白发生构象紧缩或重排，形成热力学上更稳定的蛋白-配体复合物。这种构象稳定性的变化直接表现为靶蛋白的热变性温度（Tm）发生偏移——通常表现为上移（热稳定性增强），少数情况也可表现为下移（热稳定性减弱）。传统热漂移分析（TSA）通常使用纯化蛋白在体外进行，而CETSA将其拓展至复杂细胞体系，进一步将检测维度从单蛋白扩展到全蛋白质组。
核心优势
活细胞原位
在完整活细胞中检测，保留真实生理环境
无需修饰
直接作用于原始药物，避免标记影响
全蛋白质组
单次实验监测数千种蛋白的热稳定性变化
直接证据
提供药物与靶蛋白在细胞内的物理结合证据
区分直接/间接
热稳定性偏移可辅助区分直接靶点与下游通路
脱靶评估
同时鉴定非预期结合蛋白，预测毒副作用
应用场景
药物直接靶点活细胞验证
在生理条件下验证药物与靶蛋白的直接结合
天然产物/中药活性成分靶点发现
无标记筛选复杂天然产物的直接作用靶点
表型筛选化合物的靶点反卷积
从表型效应回溯分子层面的作用靶点
药物脱靶效应与选择性评价
评估药物的选择性，发现潜在脱靶风险
药物重定位
发现已上市药物的新靶点和新适应症
研究案例
CETSA‑MS unveils novel targets engaged by rigosertib to promote anti‑tumor activity and inflammatory responses
研究背景与挑战
临床痛点：Rigosertib（RGS，ON‑01910.Na）是一种多激酶抑制剂，已进入晚期鳞状细胞癌（RDEB‑associated SCC）的2期临床以及与帕博利珠单抗联合治疗转移性黑色素瘤的2期临床试验。然而，其确切的抗肿瘤作用机制一直不明确，阻碍了临床适应症的进一步拓展。
科学问题：Rigosertib是否通过与细胞内的特定蛋白直接结合而发挥抗肿瘤作用？其结合靶点是什么？这些靶点如何介导抗肿瘤活性和炎症反应？
CETSA+MS技术应用
研究团队采用CETSA+MS（细胞热漂移分析‑质谱联用技术）进行全蛋白质组的无偏靶点筛选：
• 全局性靶点筛选：在完整活细胞中处理Rigosertib，通过梯度加热使未结合药物的蛋白变性沉淀，结合药物的靶蛋白因热稳定性增强而保持可溶。利用高分辨质谱对可溶蛋白进行全蛋白质组鉴定与定量。
• 锁定全新靶点：CETSA+MS技术成功鉴定出ERO1A（内质网氧化还原酶1α）和NQO2（NAD(P)H:醌氧化还原酶2）两个此前未知的Rigosertib直接作用靶点。
• 机制验证：实验证实，Rigosertib与ERO1A和NQO2结合后，通过诱导活性氧（ROS）产生，激活JNK信号通路，从而发挥对RAS‑MAPK信号通路的抑制作用。
主要研究发现
首次鉴定出ERO1A和NQO2为Rigosertib的直接作用靶点，为其长期未知的作用机制提供了清晰的分子解释。Rigosertib通过靶向ERO1A和NQO2，诱导ROS依赖性JNK激活，从而抑制RAS‑MAPK信号通路；同时可诱导caspase‑1活化和gasdermin裂解，激活NLRP3炎症小体依赖的炎症反应。
